Ядерний матрикс: екстракція 2М розчином NaCl.

На перший погляд вирішення питання про те, займають чи є підстави петель ДНК специфічні позиції в геномі, представляється досить простим. Як вже говорилося, екстракція ізольованих ядер 2 М розчином NaCl дозволяє отримати нерозчинні в даних умовах залишкові ядерні структури (так званий ядерний матрикс), що містять всю ядерну ДНК, організовану в закріплені на матриксі петлі. Помірна обробка таких препаратів тими ІЛП іншими нуклеазами з наступним осадженням бистроседіментірующіх структур дозволяє розділити ДНК на дві фракції. Дистальні частини петель ДНК, відрізані від ядерного матриксу, залишаються в супернатанті, тоді як фрагменти ДНК, які містять ділянки прикріплення до матриксу, знаходяться в осаді разом з бистроседпментірующімі залишковими ядерними структурами. Варіюючи інтенсивність нуклеазной обробки, можна отримувати фракції прилеглої до ядерного матриксу ДНК різного розміру. Слідуючи логіці процедури фракціонування, можна вважати, що кожен фрагмент ДНК, що виділялася в складі комплексу ДНК з ядерним матриксом, повинен включати ділянку прикріплення до матриксу і навколишні його послідовності ДНК. У цілому ряді експериментів отримані таким чином препарати прилеглої до ядерного матриксу ДНК були використані в якості зондів для гібридизації з клонованими фрагментами геномної ДНК. Результати такого роду дослідів виявилися досить несподіваними. Було продемонстровано, що до ядерного матриксу прикріплюються транскрибується і потенційно активні в даному типі клітин послідовності [Cook ea 1980, Cook ea 1982, Robinson ea 1982, Robinson ea 1983, Small ea 1985, Ciejek ea 1982, JostJ.-P., Ea 1984 , Mirell ea 1982, Razin ea 1985]. Характер взаємодії ДНК з ядерним матриксом розрізнявся в клітинах одного і того ж організму, диференційованих по різних шляхах [Ciejek ea 1982, JostJ.-P., Ea 1984, Razin ea 1985]. Ці результати були сприйняті досить скептично. Було висловлено припущення про те, що виявляється прикріплення активних генів до ядерного матриксу є артефактом, що виникають в процесі екстракції ядер концентрованим сольовим розчином. Передбачалося, що процедура екстракції може викликати преципітацію транскрипційних комплексів або їх копреціпітацію разом з молекулами новосинтезованих РНК [Mirkovich ea 1984, Kirov ea 1984, Roberge ea 1988]. Це останнє припущення було, однак, спростовано за допомогою ряду спеціальних контрольних експериментів. Було, зокрема, показано, що обробка ядер РНКази, проведена до чи після екстракції концентрованим сольовим розчином, не приводить до дисоціації активних генів від ядерного матриксу [Cook ea 1978, Vogelstein ea 1985].
Активні гени залишаються прикріпленими до ядерного матриксу та при тимчасовій зупинці транскрипції в клітинах, підданих тепловому шоку, або в ядрах, оброблених специфічними інгібіторами РНК-полімераз [Small ea 1985, Ярова ea 1985].
При вивченні кластерів генів (таких, наприклад, як кластер альбумінових генів курей) не було виявлено кореляції між рівнем транскрипції різних генів і ступенем їх представленості в препаратах прилеглої до ядерного матриксу ДНК [Ciejek ea 1983].
Зрозуміло, що така кореляція повинна мати місце, якщо транскрібіруемие послідовності виявляються в складі ядерного матриксу в результаті преципітації транскрипційних комплексів. Нарешті, було показано, що в ході примусової диференціювання клітин під дією гормонів асоціація з ядерним матриксом генів, експресогрующіхся в диференційованих клітинах, передує початку їх транскрипції [JostJ.-P., Ea 1984].
Всі ці результати показують, що прикріплення активних генів до ядерного матриксу не є прямим наслідком їх транскрипції. Хоча результати перерахованих вище дослідів і їх інтерпретація представляються нам досить переконливими, можливість артефактной преципітації активних генів в xoде обробки ядер концентрованим сольовим розчином продовжували обговорювати і в наступні роки.
Це спонукало Кука та співавт. [Jackson ea 1988] розробити альтернативну процедуру виділення прикріпленою до ядерного матриксу ДНК. Вони запропонували видаляти з ядер відрізані нуклеазами дистальні частини петель ДНК за допомогою їх електроелюціі в розчині з фізіологіческзмі значеннями іонної сили. Використовуючи дану процедуру фракціонування, автори підтвердили всі основні висновки, зроблені раніше в експериментах з сольовий екстракцією ядер. Підводячи підсумок, можна сказати, що вивчення прикріпленою до ядерного матриксу ДНК показало, що взаємодія ДНК з скелетними елементами хромосоми відбувається не випадковим чином. У той же час, отримані результати навряд чи можна було інтерпретувати в рамках простої моделі, заснованої на припущенні того, що всі фрагменти прикріпленою до ядерного матриксу ДНК є підставами петель, про які йшлося в попередньому розділі.
Треба сказати, що в дослідах, обговорення яких виходить за рамки огляду, було показано, що не тільки транскрибуються, але і реплікується [Berzney R., ea 1975, Van der Velden ea 1984, Dijkwel ea 1979, Pardoll ea 1980], а можливо , і репаруючу [McCready ea 1984, Razin ea 1986] послідовності ДНК прикріплюються до ядерного матриксу. Важко припустити, що всі ці фрагменти є підставами топологічних доменів (закріплених на ядерному матриксі / хромосомному остові петель ДНК), розміри яких однакові в інтерфазних зщрах і метафазних хромосомах і, отже, не залежать ні від транскрипційного, ні від репликативного статусу окремих генів, так само як і геному в цілому.
У цьому зв’язку поряд автором було висунуто припущення про те, що підстави топологічних доменів складають лише певну частину від загального числа ділянок прикріплення ДНК до ядерного матриксу. З метою перевірки даного припущення ми проаналізували характер взаємодії з ядерним матриксом різних областей домену а-глобінових генів курей в еритробластах (де глобінових гени активно транскрибуються) і зрілих еритроцитах, ядра яких функціонально неактивні [Farache ea 1990].
Отримані результати виявилися досить цікавими. У зрілих еритроцитах до ядерного матриксу були прикріплені послідовності ДНК, фланкуючі домен з 5′-і З’-решт, тоді як у складі ядерного матриксу еритробластів крім цих послідовностей були виявлені транскрібіруемие ділянки (власне гени). Логічно було припустити, що ділянки прикріплення ДНК до ядерного матриксу, що зберігаються в неактивних ядрах, є підставами топологічних петель ДНК. Ми назвали їх перманентними ділянками прикріплення ДНК до ядерного матриксу. У дослідах по коренатураціі препаратів прикріпленою до ядерного матриксу ДНК з еритробластів і зрілих еритроцитів курей було показано, що перманентні ділянки прикріплення складають близько 30% від загального числа експериментально виявлених ділянок прикріплення ДНК до матриксу [Razin ea 1986].
Після вичерпної нуклеазной обробки інтерфазних ядер і подальшої їх екстракції концентрованим сольовим розчином у складі ядерного матриксу залишаються короткі фрагменти ДНК, розміри яких коливаються від 50 до 150 п.н. Можна вважати, що ці фрагменти захищені від нуклеазной атаки за допомогою взаємодії з білками ядерного матриксу. Іншими словами, вони залучені до організації ділянок прикріплення ДНК до ядерного матриксу. Ми клонували такі короткі фрагменти ДНК, виділені з ядерного матриксу зрілих еритроцитів курей (тобто походять з перманентних ділянок прикріплення ДНК до матриксу), і проаналізували нуклеотидні послідовності ряду таких фрагментів [Каландадзе ea 1988].
Хоча ніякого консенсусу виявлено не було, проаналізовані послідовності мали ряд спільних рис, що виражаються в наявності блоків пуринових і піримідинових нуклеотидів, недосконалих паліндромів і недосконалих коротких повторів (так званих простих послідовностей). Аналогічні спостереження були зроблені й іншими авторами при аналізі послідовностей коротких фрагментів прикріпленою до ядерного матриксу ДНК, виділених з клітин, синхронізованих на кордоні Gl / S-фаз.

Comments are closed.