Вторинні месенджери.

Гормони, нейромедіатори і інші агоністи здатні швидко активувати внутрішньоклітинні процеси. Агоністи взаємодіють з рецепторами на зовнішній стороні клітинної мембрани, далі сигнал передається в клітину шляхом активації синтезу так званих вторинних посередників. Список вторинних месенджерів включає cAMP (циклічний гуанозин-3 ‘, 5′-монофосфат) cGMP (циклічний гуанозин-3′, 5’-монофосфат), фосфоінозитиду, іони кальцію і H +, метаболіти ретиноєвої і арахідонової кислот, закис азоту (NO), та інші хімічні сполуки біогенного походження.

Першим з них був описаний АМФ циклічний в 50-х роках [Sutherland, 1957; Rall EA, 1957]. Далі був відкритий ще один вторинний месенджер – циклічний ГМФ [Hardmann, 1962], наступним великим досягненням стало відкриття функції вторинних месенджерів-продуктів фосфоіназітідного обміну: діацілгліцерін і інозитол-1 ,4,5-трифосфату, [Berridge, 1984]. В результаті дії внутрішньоклітинних посередників передачі сигналів включаються процеси фосфорилювання білків, активації їх іонами кальцію або іншими чинниками, що призводить відповіді на рівні клітин: секреції, скорочення, індукції різних генів, проліферації та ін
cAMP (цАМФ) система

3 ‘, 5′-CYCLIC AMP

АМФ циклічний (cAMP; структурну формулу див. ріс.43) є універсальним посередником передачі внутрішньоклітинного сигналу із зовнішнього боку клітинної мембрани до ефекторних систем клітини, дія яких викликає генералізовану реакцію клітини на вплив зовнішнього біологічно-активної речовини, наприклад гормону.

цАМФ синтезується з АТФ при посередництві ферменту аденілатциклази.

цАМФ – основний вторинний посередник. Протягом деякого часу після відкриття цАМФ в 1950 році він вважався вторинним месенджер для всіх гідрофільних гормонів. Зв’язування цих гормонів з рецептором збільшує вміст цАМФ в клітці в результаті активації ферменту аденілатциклази, який перетворює АТФ (аденозинтрифосфат) цАМФ (рис.1-9сер). цАМФ потім стимулює Другий фермент, протеїн, яка фосфорилювання ряд інших білків. Останні зазвичай є ферментами, які існують в активній та неактивній формах, в залежності від того, піддалися вони фосфорилюванню чи ні.

Таким чином, гормони, які діють через цАМФ, здійснюють свою біологічну функцію шляхом фосфорилювання специфічних ферментів і за допомогою цього змінюють (збільшують або зменшують) їх активність.

Нарешті, повинен існувати якийсь механізм видалення внутрішньоклітинного цАМФ, після того як гормон припиняє своє існування. Це видалення здійснюється всюдисущим ферментом, фосфодіестерази, яка перетворює цАМФ в неактивний метаболіт аденозинмонофосфат (АМФ).

У ряді випадків позаклітинні ліганди після взаємодії з рецепторами індукують утворення вторинних месенджерів через участь GTP-зв’язуючих і GTP-гідроліз гетеродімерних білків, названих G-білками.

У цих системах має місце послідовність реакцій, відображена на рис. I.23, а. Позаклітинний ліганд специфічно розпізнається трансмембранним рецептором, який, у свою чергу, активує відповідний G-білок, локалізований на цитоплазматичної поверхні мембрани. Активоване G-білок змінює активність еффектора (ферменту або білка іонного каналу, в даному випадку – аденілатциклази), який підвищує внутрішньоклітинну концентрацію вторинного месенджера (в даному прикладі – cAMP). Кожен вид рецептора взаємодіє тільки з певним представником сімейства G-білків, а кожен G-білок – зі специфічним класом ефекторних молекул. Таким чином, в одному конкретному випадку гормон або нейромедіатор, реагуючи зі своїм рецептором, викликає активацію GS-білка, стимулюючого аденілатциклазу. Цей фермент-ефектор перетворює внутрішньоклітинний ATP в cAMP – класичний вторинний месенджер. Внутрішньоклітинний рівень cAMP може специфічно знижуватися під дією фосфодіестерази, яка перетворює cAMP в 5′-AMP.

cAMP активує безліч cAMP-залежних протеїнкіназ, кожна з яких фосфорилирует певні білки-субстрати. У більшості клітин тварин присутні дві cAMP-залежні протеїнкінази, фосфорилюється білки-мішені по залишках Ser і Thr (серин / треоніновие кінази).

Специфічність регуляторних впливів cAMP забезпечується наявністю в клітинах певних типів тільки їм притаманних тканеспеціфіческіх білків, які є субстратами для A-кіназ. Наприклад, клітини печінки збагачені фосфорілазой-кінази і глікогенсінтази, активність яких регулюється виборчим фосфорилюванням по cAMP-залежному механізму, що супроводжується накопиченням або звільненням вуглеводів в гепатоцитах, адипоцитах збагачені ліпазою, фосфорилювання якої за тим же механізмом призводить до звільнення жирних кислот, і т. д.

При зниженні концентрації гормонів в позаклітинному середовищі внутрішньоклітинний вміст Самро швидко зменшується, так як фосфодіестерази перетворює сАМР в 5’-AMP. Одночасно відбувається дефосфорилювання білків-мішеней A-кіназ під дією фосфатаз. Активність деяких фосфатаз також регулюється по cAMP-залежному механізму. Крім того, більшість клітин синтезує білок, названий інгібітором протеїнкінази (PKI), який блокує активність C-субодиниць A-кінази. Це супроводжується інактивацією відповідних факторів транскрипції і придушенням експресії регульованих ними генів.

AC (аденілатциклазу) і сАМР, історія

Вперше сАМР був виявлений Сазерлендом в 1957 році, коли він показав на гепатоцитах новонароджених щурів, що ефект норадреналіну або глюкагону обумовлений низькомолекулярним стійким до нагрівання з’єднанням. Зараз відомо, що у дорослих щурів сигнал адреналіну або глюкагону передається через рецептори, пов’язані з фосфолипазой C. Вже пізніше було показано, що при зростанні і розвитку щурів з 6 по 60 день після народження експресія b-рецепторів у печінці падає, а a1-збільшується. Однак молекулярне опис з’явилося лише в 1990 році.

AA (аденілатциклазу): загальні відомості

ATP PYROPHOSPHATE-LYASE (CYCLIZING) (ADENYLATE CYCLASE; ADENYLYLCYCLASE; ADENYL CYCLASE; 3 ‘, 5’-CYCLIC AMP SYNTHETASE)

Каталізує утворення

cAMP: ATP = 3 ‘, 5′-CYCLIC AMP + PYROPHOSPHATE (ALSO ACTS ON DATP TO FORM 3′, 5’-CYCLIC DAMP.REQUIRES PYRUVATE. ACTIVATED BY NAD (‘+) IN PRESENCE OF EC 2.4.2.31)

Рекомендоване назву – аденилатциклаза. Інші назви – аденілілціклаза, аденілатциклази, 3 ‘, 5′-cAMP-синтетаза. Систематичне назву – ATP-пірофосфат-ліази (ціклізуется). Катализируемая реакція:

ATP = cAMP + PPi аденілатциклази трансмембранний білок, частина поліпептидного ланцюга котоpого знаходиться на зовнішній поверхні мембрани [Krupinski J., 1989].

Аденілатциклаза (аденілатциклази) – фермент класу ЛіАЗ. Міститься в цитоплазматичних мембранах клітин. Активується деякими гормонами.

Аденілатциклази каталізують синтез цАМФ, всюдисущого і, можливо, найважливішого вторинного месенджера в клітинах тварин. Найбільш істотна роль цАМФ полягає в активації цАМФ-залежних протеїнкіназ (РКА). Будучи активований цей мультімерний фермент фосфорилирует (за участю АТФ) той чи інший з безлічі біологічно активних білків, представлених в клітці – ферментативних, рецепторних і канальних білків, ядерних гістонів, факторів транскрипції і т.д. Фосфорилюються, як правило, серинові, треоніновие або тірозіновие залишки, що призводить або до інгібування (СР згадану вище десенсітізацію G-білок-зв’язаних рецепторів), або активації білка. Подальше дефосфорилирование, відновлюючу початковий стан, забезпечується одним з безлічі фосфатазной ферментів ціітозоля. Молекулярно-біологічними методами показано існування в клітинах ссавців принаймні шести різних аденілатциклази. Всі вони мають молекулярну масу близько 120 – 130 кДа, а дослідження їх гідрофобною частини показує наявність 12 трансмембранних сегментів.

Шість ціклаза розрізняються по чутливості до бета-гамма-комплексу G-білків і до Са2 +-зв’язує білком кальмодуліном. Аденілатциклаза типу 1, наприклад, стимулюється Са2 +-кальмодуліном і інгібується бета-гамма-димеру, тоді як аденилатциклаза типу 2 не реагує на перший і стимулюється другим.

Генетичні [Livingtone MS, 1984] та біохімічні [Pfeuffer E., 1985; Mollner S., 1989; Smigel MD, 1986; Minocherhomjee AM, 1987] дані показали, що гормон-залежна аденилатциклаза в тканинах ссавців існує в множинних формах (по крайней щонайменше в трьох), що відрізняються між собою за молекулярною масам, амінокислотної послідовності і чутливості до гормонів, Ca2 +, калмодуліном і кардіоактівному дітерпену-форскаліну.

У тканинах мозку бика міститься дві форми аденілатциклази:

основна (тип 1), що має молекулярну масу 115-120 кДа [Smigel MD, 1986] і здатна активуватися калмодуліном ом.

Друга форма (тип II) не чутлива до калмодуліном і локалізована, в основному, в печінці, легенях і серці бика і кролика [Mollner S., 1989] мала молекулярну масу 150 кДа.

Третя форма аденілатциклази (тип III) виявлена ​​в нюхових війках [Pfeuffer E., 1989] і мала молекулярну масу 180 кДа, не чутлива до калмодуліном. число обертів ферменту типу III в 3 рази вище в порівнянні з ферментом типу I. Зміст ферменту типу III в мембранах нюхових війок в 100 разів вище, ніж типу I в звичайних міокардіомембранах [Pfeuffer E., 1989]. У нюхових тканинах не виявлено аденілатциклази типу I [Pfeuffer E., 1989]. Однак мРНК аденілатциклази типу III виражалася не тільки в нюхових тканинах, її виявлено в мозку, спинному мозку, мозковому шарі надниркових залоз, сітківці ока, передсерді, аорті, легенів [Xio Z., 1992].

Фермент типу III входить в аденілатціклазную систему, чутливу до багатьом одоранту [Pace U., 1985] і містить специфічний G-білок – Golf [Jones DT, 1989].

Аденілатциклаза типу I є глікопротеїном [Krupinski J., 1989], фермент типу III містив два додаткових ділянки глюкозілірованія [Bakalayar HA, 1990]. Обробка останнього в неочищених екстрактах глюкозидази знижувало молекулярну масу від 180 кДа до 129 кДа [Bakalayar HA, 1990].

З сім’яників пацюка виділена розчинна форма аденілатциклази, неактівіруемая гормонами, гуаніновимі нуклеотидами і холерним токсином [Stengel D., 1981], слабо активується аналогом CTP-Cpp (NH) p-(гуанілілімідодіфосфатом) і має молекуляную масу 57 кДа [Neer EJ, 1988] .

Для прояву активності аденілатциклази необхідна присутність іонів двовалентних металів: Mg2 +, Mn2 + або Co2 + Фермент міг використовувати в якості субстрату ATP і dATP з утворенням cAMP і cdAMP Інші нуклеозідтріфосфати (TTP, CTP, YTP і dTTP) певною мірою були інгібіторами ферменту. Активність ферменту чутлива до присутності SH-реагентів [Perkin JL, 1973].

Регуляція активності аденілатциклази складна й різноманітна і включає як позаклітинні так і внутрішньоклітинні сигнали. Регуляція активності аденілатциклази внаслідок впливу на клітину зовнішнього сигналу (гормонів, простогландинів, нейротрансмітерів) здійснюється через специфічні рецептори, взаємодіючи з одним або більше з сімейства, змінюють їх конформацію, які, в свою чергу, у присутності GTP активують безпосередньо каталітичну одиницю аденілатциклази [Gilman AG , 1989]. Два типи лігандів контролюють активність ферменту: активуючі гормони і нейротрансмітери, що зв’язуються з відповідними рецепторами і активують фермент через Gsa і інгібуючі гормони і нейротрансмітери, що зв’язуються з інгібіторної рецепторами і інгібують фермент через Gia [Gilman AG, 1989; Levitzki A., 1986]. Молекулярний механізм регуляції активності ферменту в аденілатціклазной системі див. G-білки.

GTP і його негідролізуемие аналоги, гуанілілімідодіфосфат (Cpp (NH) p), гуанозин-5’-0-3-тіотріфосфат (GTP-гамма-S), стабілізуючі фермент, активують аденілатциклазу через G-білки і можуть бути конкурентним інгібітором субстрату [Северин Е.С., 1985]. Кардіоактівний дітерпан-форскалін безпосередньо взаємодіє з ферментом викликаючи його активацію [Seamon K., 1981].

Простагландини модулюють активність аденілатциклази що виражається, наприклад, у регуляції агрегації тромбоцитів або інгібуванні дії антидіуретичного гормону в нирках.

AC (аденілатциклази) розчинні

Гормонрегуліруемие аденілатциклази є інтегральними білками плазматичної мембрани.

Існують і розчинні форми ферменту, до яких відносять AC бактерій і AC сперми ссавців.

AC – це глікопротеїни з мол.массой від 110 до 180 кД і числом амінокислотних залишків від 106 до 128. Поліпептидний ланцюг містить 12 гідрофобних трансмембранних доменів (6х2, по 20-22 амінокислотних залишку), що утворюють структури схожі на канал, але не проявляють якої-небудь канальної активності .

Гідрофобні домени об’єднані в дві групи (по 6 у кожній). Між цими групами з боку цитоплазми вставлений фрагмент поліпептидного ланцюга (3 кД). Із зовнішнього боку ці ділянки невеликі і містять місця для N-глікозилювання. N і С кінці розташовані з цитоплазматичною боку.

Великий домен (38 кД) розташований з боку С-кінця. АТР-зв’язуючий ділянку виявлений методом моделювання та аналізу мутацій в області Р-сайту. Показано, що Lys-923 і Asp-1000 з С2-домену взаємодіють з N1 і N6 аденінових кільця АТР, а Gln-17 з С1-домену бере участь в орієнтації Lys-923. Mg2 +-зв’язуючий ділянку містить два залишку Asp.

AC (аденілатциклази): активація та інгібування

Актіватормі AC є a-субодиниця Gs-білка і CaKM. Активація AC відбувається внаслідок утворення комплексу з a-субодиницею Gs-білка (рис 4.2). b-адренергіческіе рецептори активують AC, а a2-адренергічні рецептори інгібують її. b-рецептори діють через стимулюючий Gs-білок, а a2-рецептори – через інгібіторний Gi-білок, який містить той же b-гамма-комплекс, що і Gs-білок, але іншу a-субодиницю (Gi-a). Будучи активований, a2-адренергічні рецептор взаємодіє з Gi-білком, приводячи до заміни GDP на GTP в ділянці зв’язування гуанінових нуклеотидів на a-субодиниці. При цьому, як вважають, a-субодиниця відділяється від b-гамма і обидві ці субодиниці беруть участь в інгібуванні AC: Gi-a безпосередньо пригнічує активність AC, тоді як b-гамма зв’язують вільні Gia і, як наслідок, припиняється активуючий вплив на AC. Див AC (аденілатциклазу): регуляція активності токсинами.

Передача гормональних сигналів: аденілатціклазной шлях

З рецептором зв’язується гормон. При цьому активується G-білок. Неактивний G-білок конститутивно зв’язаний з рецептором. Його альфа-субодиниця в неактивному стані пов’язана з GDP. Вона володіє GTP-азной активністю. При активації GDP відділяється, а з альфа-субодиницею зв’язується GTP. Комплекс GTP з? – Субодиницею відділяється від рецептора і від двох інших субодиниць G-білка. Він активує аденілатциклазу (AC). Утворюється cAMP, який зв’язується з регуляторними субодиницями тетрамерной ферменту, з-АМР-залежної Ser / Thr протеїнкіназ (PKA). Зв’язування призводить до звільнення каталітичної субодиниці (С), яка фосфорилирует кілька білків у цитоплазмі, включаючи онко білок Raf. Ця протеїнкіназа також переміщається в ядро ​​і там фосфорилирует кілька факторів транскрипції, що відносяться до групи Creb-факторів (c-AMP response element binding protein). Фосфорілірованний Creb зв’язується зі своєю мішенню в ДНК. [Montminy ea 1997]. В результаті стимулюється або, навпаки, інгібується проліферація клітини. Описаний шлях передачі відноситься до активації аденилат ціклаза. Більш докладно про це – в наступному нарисі. Цей шлях здійснюється так званими Gs-білками.

Comments are closed.