Рецептори: виділення та ідентифікація.

Основний метод ідентифікації рецепторів у клітинах або субклітинних структурах (і практично єдиний, застосовуваний при очищенні рецепторів) – вимір зв’язування агоніста або антагоніста. Специфічне зв’язування агоністів з рецепторами протікає по кінетиці з насиченням. Це швидкий і оборотний процес. На відміну від неспецифічного таке зв’язування блокується хімічними аналогами даного агоніста. Якщо існують два стереоізомерів речовини, то один з них, як правило, зв’язується з рецепторами набагато краще іншого. Для неспецифічного зв’язування відмінності в стеричних конфігурації речовин звичайно не істотні. Перераховані особливості лежать в основі існуючих нині методів вивчення взаімодествіі речовин з рецепторами.

Вельми ефективним інструментом у вивченні рецепторів є метод злиття різних клітин. Див рецептори: дослідження шляхом злиття клітин

Усі рецептори, відомі в даний час, виявлені по біологічних ефектів гормонів. Агоністи і антагоністи гормонів також виявляються в основному у фізіологічних експериментах. Якщо гормон впливає на функціональну або метаболічну активність тканини (наприклад, викликає деполяризацію мембран або утворення вільних жирних кислот), говорять про наявність у даної тканини рецепторів для цього гормону. Про силу дії агоністів судять, порівнюючи їх біологічні ефекти з ефектом гормону; антагоністи виявляють по блокуванню цих ефектів. Так, наприклад, багато холіноміметики виявлені шляхом порівняння величини деполяризації або гіперполяризації, спричиненої ацетилхоліном і досліджуваним речовиною, а холінолітики – по здатності зменшувати дію ацетилхоліну на мембранний потенціал. Подібним чином була складена і класифікація адренергічних агентів. При цьому експериментатор, як правило, вивчає залежність ефекту (потенціал, розпад глікогену або звільнення жирних кислот) від концентрації гормону, його агоністів та антагоністів і тим самим оцінює спорідненість цих агентів до рецептора. Абсолютні величини констант, одержувані в такого роду експериментах, в більшості випадків є удаваними. Вони можуть на кілька порядків відрізнятися від істинних констант зв’язування гормону з рецептором.

Виділення рецепторів утруднено в зв’язку з їх низькою концентрацією, а також тим, що після руйнування клітин, виділення і очищення субклітинних структур рецептори, локалізовані в цих структурах, не можна тестувати за їх біологічним ефектам, так як в більшості випадків біологічний ефект опосередковується узгодженою роботою багатьох структур , а часом і зовсім вимагає цілісності клітини або навіть певного багатоклітинного ансамблю.

Поверхня типовою клітини містить 10000 – 20000 рецепторів до окремого гормону, що відповідає 10-6 від загального білка клітини. Для виділення рецепторів насамперед слід солюбілізіровать інтегральні білки мембрани за допомогою неіоннного детергенту. Солюбілізірованний таким чином рецептор далі може бути очищений за допомогою афінної хроматографії. У цьому випадку ліганд відповідного рецептора хімічно зв’язується зі спеціальною матрицею (наприклад, полістиролових кульки). Далі груба фракція мембранних білків пропускається через таку колонку. І тільки рецептор зв’яжеться зі своїм лігандом. Тим не менше, для багатьох гормонів кількість рецепторів на клітинній поверхні занадто мало для того, щоб отримувати їх з використанням афінної хроматографії. Тому ключові рецепторні білки можуть бути отримані за допомогою ДНК-клонування та інших рекомбінантних ДНК методов.Так, наприклад, після отримання очищеної фракції плазматичних мембран альфа-адренергічні рецептори не вдається тестувати щодо підвищення проникності цих мембран для Ca2 +, так як такі мембрани зазвичай стають вільно проникними для всіх іонів. Тестувати бета-адренергічні рецептори щодо прискорення ліполізу не можна після руйнування жирової тканини і виділення мембран. Однак ці мембрани містять аденілатциклазу, активація якої є першим етапом у процесах прискорення ліполізу бета-адренергічними агоністамі.Тестіруя бета-рецептори по активації аденілатциклази, можна виділити і очистити плазматичну мембрану, в якій локалізовані і бета-рецептори і аденилатциклаза. Наступним етапом повинна бути солюбілізація мембрани детергентами або органічними розчинниками, так як практично всі мембранні рецептори – інтегральні білки. Після солюбілізації аденилатциклаза зберігає свою активність, але втрачає здатність активуватися гормонами, тому при подальшому очищенні рецепторів вже не вдається проводити “функціональний” контроль.

Comments are closed.