Метаболізм інозитол містять фосфоліпіди.

Передача сигналів від багатьох рецепторів, сполучених з G-білками, відбувається за допомогою інозитол-1,4,5-трифосфату і 1,2-діацілгліцерін. Ці речовини утворюються при гідролізі мембранного ліпіду – фосфатидилинозитол-4 ,5-дифосфату. Інозитол-1,4,5-трифосфат викликає вивільнення кальцію з внутрішньоклітинних структур, тоді як 1,2-діацілгліцерін активація протеїн С. Інозитол-1,4,5-трифосфат і 1,2-діацілгліцерін беруть участь у регуляції клітинної проліферації і диференціювання та опосередковує дію багатьох гормонів, зокрема – АДГ (через рецептори типу V1) і бомбезін.

Обмін фосфоінозітідний і кальцій: історія питання
Минуло майже 50 років з тих пір, як Мейбел Хокін і Лоуелл Хокін, намагаючись з’ясувати механізм активації ацетилхоліном секреції амілази підшлункової залозою, виявили, що ацетилхолін активує метаболізм фосфоліпідів у зрізах цього органу, збільшуючи майже на порядок включення фосфату в фосфоліпідний фракцію (Hokin, Hokin , 1953). Пізніше було показано, що радіоактивний фосфат включається до складу фосфатидилінозитолу і фосфатидного кислоти (Hokin, Hokin, 1955; Hokin, Hokin, 1958). Трохи пізніше була визначена структура основних фосфоліпідів, що містять міо-інозитол: фосфатидилінозитолу (фін), фосфатидил-інозитол-4-фосфату (Фін-4-Ф) і фосфатидилинозитол-4 ,5-бісфосфат (Фін-4 ,5-Ф2 #) (Grado, Ballou, 1961; Tomlinson, Ballou, 1961; Brockkerhoff, Ballou, 1961). B 1969 Д’юрел і співавтори припустили, що першою ланкою в механізмі передачі гормонального сигналу є гідроліз фосфолипазой З фосфоінозідов Фін, Фін-4-Ф і фін-4 ,5-Ф2 #, причому утворюються при цьому негативно заряджені водорозчинні фосфати інозитол безпосередньо беруть участь в перенесенні катіонів Na і K. Заслуга даних авторів полягала в тому, що вони першими звернули увагу на можливий зв’язок між інозітолфосфатамі і іонним струмом через мембрану. Наступний крок був зроблений Робертом Мічелл. У 1975 р. він зауважив, що фосфоінозідний обмін активізується тими ж гормонами, які викликають надходження Са в клітку і стимулюють синтез цГМФ. На підставі цього він припустив, що активація фосфоінозітідного гідролізу якимось чином викликає відкривання кальцієвих каналів плазматичної мембрани (Michell, 1975). Гіпотеза Мічелл, невірна, як потім виявилося, в деяких деталях, але правильна по суті, послужила потужним стимулом для подальших досліджень. Наступним важливим етапом було відкриття того, що першою реакцією при впливі гормонів на клітину є гідроліз не основного інозітолсодержащего ліпіду фосфатидилінозитолу, а мінорного компонента фосфатидилинозитол-4 ,5-бісфосфат (Abdel-Latif et al., 1977; Kirk et al., 1981) .

Незабаром з’явилася можливість використовувати [3 # H]-міо-інозитол для включення радіоактивної мітки в мембранні фосфоінозіди. Для цього клітини тривалий час інкубували з міченим миоинозитола, потім відмивали від нього і додавали гормони. За допомогою такого методу, який тепер застосовується повсюдно, було показано, що при впливі гормонів в клітинах в перші ж секунди відбувається накопичення мічених тритієм інозитол-4 ,5-бісфосфат (Ін-4 ,5-Ф2 #) та інозитол-1,4 ,5-трісфосфата (Ін-1 ,4,5-Ф3 #) (Berridge et al., 1983). Це відкриття по часу майже збіглося з першими експериментами по вимірі концентрації іонів Са в цитоплазмі клітин за допомогою флуоресцентного зонду Квін-2 (Rink, 1983), які показали, що гормони викликають як вивільнення Са із внутрішніх депо, так і вхід Са зовні в цитоплазму. Всі ці дані логічно підводили до гіпотези, висловленої Беррідж, згідно з якою водорозчинний продукт реакції гідролізу Фін-4 ,5-Ф-інозитола-1,4,5-трифосфат (Ін-1 ,4,5-Ф3 #) може викликати викид Са із внутрішніх депо (Berridge, 1983). Аналогічна картина була показана практично у всіх досліджених в цьому відношенні тваринних клітинах і тканинах, окрім поперечно мускулатури. Зрозуміло, ці дані не заперечували можливого зв’язку між активацією гормонами фосфоінозітідного обміну і входу Са із зовнішнього середовища, проте перші повідомлення, які прямо вказують на такий зв’язок, з’явилися значно пізніше (Kuno, Gardner, 1986) і досі в цьому процесі немає повної ясності .

Подальші успіхи у вивченні метаболізму інозітолфосфатов багато в чому були обумовлені застосуванням Болле ефективного методу їх розподілу в порівнянні з іонообмінної хроматографією на Дауксе (Berridge et al., 1983) – методу високоефективної рідинної хроматографії або хроматографії під високим тиском. В якості носія в колонках використовували сильний анионообменниками на основі четвертинного амонію – Partisil SAX (фірма “Whatman”). Спочатку за допомогою цього методу було показано утворення в клітинах ще одного інозітолтрісфосфата, фосфорильованого по 1, 3 і 4 положенням, Ін-1 ,3,4-Ф # (Irvine et al, 1984; Burgess et al., 1985) а потім і його попередника інозитол-1, 3,4,5 – тетракісфосфата, який утворюється при фосфорилировании Ін-1 ,3,4,5-тетракісфосфата, який утворюється при фосфорилировании Ін-1, 4,-Ф #. Крім того, в різних клітинах виявлені інші ізомери ІнФ4 #, концентрація яких зростає при впливі гормонів, а також виявлено високий рівень ІнФ5 # і ІнФ6 # (фітину) (Hansen et al., 1988; Tilly et al., 1987; Szwergold et al ., 1987; Kirk et al., 1989). Концентрація ІнФ5 # і ІнФ6 # в клітинах не зазнає швидких змін під дією гормонів. При вивченні містять інозитол фосфоліпідів у 80-х роках були зроблені цікаві відкриття. Виявлено три нових фосфоінозитиду, в яких фосфат включений в третє положення в залишку інозитола – фін-3-Ф, Фін-3 ,4-Ф # і фін-3 ,4,5-Ф # (Whitman et al., 1988). Знайдений глікозильований фосфатидилинозитол, випоняемие функцію якоря для деяких білків, розташованих із зовнішнього боку плазматичної мембрани (Low, Saltiel, 1988).

Фосфоліпіди, що містять інозитол (фосфоінозитиду)
Сумарна кількість фосфоліпідів, що містять інозитол (фосфоінозитиду), в клітинних мембранах еукаріотів становить від 2 до 8%, (Majerus et al., 1986), причому найбільша частка припадає на фосфатидилинозитол.

Фосфатидилинозитол (PI) – мінорний ліпід клітинної мембрани (рис. 11). Також в ній присутні похідні PI: PI-4-фосфат (PI4P) і PI-4 ,5-біфосфат (PI4, 5P2).

Основна частина фосфатидилінозитолу знаходиться у внутрішніх мембранах, а фосфоінозитиду, що мають у своєму складі велику кількість фосфатних груп фосфатидилинозитол-4-фосфат, фосфатидилинозитол-4 ,5-бісфосфат та ін), розташовані переважно в плазматичних мембранах.

Біосинтез фосфатидилінозитолу здійснюється в мікросомах і, мабуть, в плазматичній мембрані в результаті ресі1нтеза під час “прокручування” реакції фосфоінозітідного циклу

Фосфоліпіди, що містять інозитол (фосфоінозитиду): функції

Крім чисто структурної ролі фосфоінозитиду, як компонентів біслойной ліпідної мембрани, вони виконують цілу низку важливих фізіологічних функцій (Berridg, Irvine, 1989).

Вони є попередниками вторинних посередників. Фосфатидилинозитол фосфорилюється до фосфатидил-інозитол-4-монофосфату, а потім до фосфатіліоінозітол-4,-бісфосфат (див. мал.38). Фін-4 ,5-Ф2 # гідролізується фосфолипазой С до діацілгліцерін і інозитол-1 ,4,5-трісфосфата, які є вторинними посреднкамі кальцієвого обміну.

До складу фосфоінозитиду цієї групи входять в основному стеаринова і пальмітинова (по першому положенню гліцерину) та арахідонова (по другому положенню) кислоти.

Іншою важливою функцією фосфоінозитиду є так звана якірна функція – до них прикріплюються численні білки зовнішньої поверхні клітини (мал.36). Для фосфоінозитиду, службовців якорем мембранних білків, характерний високий вміст миристиновой кислоти. У якірних фосфоінозитиду інозітольная частина ліпіду гліколізірованного. Зв’язок білків з фосфоінозітідгліканамі здійснюється через кінцевий етаноламін.

Синтез або гідроліз фосфолипазой З цього типу ліпідів (фосфоінозітідгліканов) робить можливим швидке приєднання, або відділення від мембрани білків, не пов’язаних з фосфоліпідної мембраною безпосередньо.

Подібного роду швидке звільнення пов’язаних з мембраною білків, що каталізують фосфоліпазою С, відбувається при зміні зовнішнього білкового покриву у трипаносом (Low, Saltiel, 1988).

У деяких клітинах виявлений фосфоінозітідглікан, у якого відсутня етаноламін і він не може приєднувати до себе білки. Цей гліколіпіди розщеплюється специфічною фосфоліпазою С, яка активується інсуліном. Є дані, що утворюється при гідролізі глікозильованого фосфоінозитиду ГЛІКАНА інозітолфосфата опосередковує деякі внутрішньоклітинні ефекти інсуліну (Saltiel, Cuatrecasas, 1986; Saltiel et al., 1986, Low, Slatiel, 1988).

У 90-х роках була виявлена ​​ще одна група інозітолсодержащіх фосфоліпідів, у яких фосфат включений в 3-е положення інозитол. Це фосфатидилинозитол-3-монофосфат, фосфатидилинозитол-3 ,4-бісфосфат і фосфатидилинозитол-3 ,4,5-трісфосфат. Їх синтез каталізується кіназою фосфоінозитиду I типу (див. мал.38), що відрізняється від кінази фосфоінозитиду II типу, що включає фосфат в положення 4 (Carpenter et al., 1990).

Нові фосфоінозитиду були виявлені під час вивчення функції білка, кодованого протоонкогенів c-src.

Висловлювалося припущення, що кіназа I типу відіграє важливу роль у регуляції клітинної поліфераціі. Ця гіпотеза підтверджується даними про те, що фактор росту з тромбоцитів (ФРТ) активує кіназу фосфоінозитиду I типу і викликає накопичення поліфосфоінозітідов, що мають фосфат в 3-му положенні інозитола (Auger et al., 1989). При цьому ФРТ викликає утворення комплексу власного рецептора і кінази фосфоінозитиду I типу. Виявилося, що мутантні рецептори ФРТ, не володіють здатністю зв’язуватися з кіназою I типу, не стимулюють клітинний ріст.

Роль кінази I типу не обмежується тільки участю в клітинної проліферації. Накопичення продукту цієї реакції під дією тромбіну та інших агоністів виявлено в тромбоцитах (Kucera, Rittenhouse, 1990 ;).

Короткострокове накопичення в мембрані фосфатидилінозитолу-3 ,4,5-трісфосфата відбувається при стимуляції нейтрофілів. Його утворення добре корелює з полімеризацією актину. Враховуючи дані про здатність поліфосфоінозітідов приєднувати актінсвязивающій білок профілін, було припущено, що фін-3 ,4,5-Ф3 # бере участь у перебудовах цитоскелету.

Фосфоінозитиду: гідроліз фосфолипазой З: продукти

Зв’язування зі своїми рецепторами багатьох гормонів, нейромедіаторів, факторів росту, освітлення фоторецепторів в сітківці ока призводить до активації фосфоліпази С, гідроліз Фін-4 ,5-Ф2 до діацілгліцерін а й інозитол-1, 4,5 – тріcфосфата (див. огляди Shears, 1989; Downes, Macphee, 1990). Поряд з Ін-1 ,4,5-Ф3 в ході реакції утвориться деяка кількість циклічного інозитол-1 ,4,5-трісфосфата Ін-ц 1:2,4,5-Ф3 (Wilson et al., 1985). Зменшення значення рН середовища, тобто зниження концентрації іонів ОН-, зрушує напрямок реакції в бік утворення циклічного похідного (Dawson et al., 1971). У той же час при дуже низьких значеннях рН Ін-ц 1:2,4,5-Ф3 та інші циклічні інозітолфосфати нестабільні і гідролізуються. За даними Секара і співавт., Частка Ін-ц 1:2,4,5-Ф3, накапливающегося при активації клітин підшлункової залози карбахоліном, становить близько 30% від Ін-1 ,4,5-Ф3 (Sekar et al., 1987 ). Співвідношення цих двох продуктів визначається як швидкістю синтезу Ін-1 ,4,5-Ф3 # і його циклічного аналога, так і швидкістю їх розпаду. У клітинах острівців Лангерганса підшлункової залози викликаний ацетилхолін ом підйом рівня Ін-Ц1 :2,4,5-Ф3 запізнюється в порівнянні з піком освіти Ін-1 ,4,5-Ф3, а час, протягом якого концентрація циклічного інозітолтрісфосфата залишається підвищеною, також значно тривалішим, ніж час життя Ін-1 ,4,5-Ф3 (Dixon, Hokin, 1987).

PLC (Фосфоліпаза C): реакції
Основним субстратом фосфоліпази С є Фін-4 ,5-Ф2 #. У інтактних клітинах при дії гормонів в перші секунди відбувається накопичення Ін-1 ,4,5-Ф3 # і зниження вмісту Фін-4 ,5-Ф2 #.

Однак показана принципова можливість гідролізу фосфолипазой С та інших фосфоінозитиду: Фін і фін-4-Ф. До середини 90-х років було виділено і охарактеризовано не менше п’яти різних ізоформ фосфоліпази С (Crooke, Bennet, 1989; Rhee et al., 1989; Rhee 1992), і кожен з цих ізоферментів може гідролізувати всі три фосфоінозитиду з утворенням шести продуктів:

трьох нециклічних – Ін-1-Ф, Ін-1 ,4-Ф2 #, Ін-1 ,4,5-Ф3 # і

трьох циклічних – Ін-ц 1:2-Ф, Ін-ц 1:2,4-Ф2 #, і Ін-Ц1 :2,4,5-Ф3 # інозітолфосфатов (Majerus et al., 1988).

Гідроліз фосфолипазой З фосфоінозитиду, у яких фосфатна група включена в третє положення – фін-3-Ф, Фін-3 ,4-Ф2 # і фін-3 ,4,5-Ф3 # (Whitman et al., 1988; Kucera, Rittenhouse , 1990), мабуть, не відбувається.

У фізіологічних умовах фосфоліпаза С розщеплює переважно фін-4-Ф і фін-4 ,5-Ф2 #. В експериментах на пермеабілізірованних тромбоцитах Хаслемом і співавт. показано, що при активації фосфоліпази С тромбіном і гуанілова нуклеотидів гідролізуються два ендогенних фосфоінозитиду-фін-4-Ф і фін-4 ,5-Ф2 # (Culty et al., 1988). Ці дані узгоджуються з результатами, отриманими ще в піонерській роботі Беррідж (Berridge, 1983), який показав одночасне накопичення в гроздевідним (ацинарних) клітинах підшлункової залози Ін-1 ,4-Ф2 # і Ін-1 ,4,5-Ф3 # при дії ацетилхоліну.

Активація гідролізу фосфатидилінозитолу гормонами, ймовірно, також може мати місце, однак це явище має швидше за все вторинний характер. Спочатку агоністи викликають підвищення Ca (Можливе, локальне), а потім активується гідроліз фосфатидилінозитолу. Справа в тому, що розщеплення цього фосфоліпіду фосфолипазой С відбувається при підвищених концентраціях Са, тоді як для гідролізу Фін-4-Ф і фін-4 ,5-Ф2 # достатньо субмікромолярних концентрацій іонів Са (близько 10-7 # М), т. тобто того рівня, який є в цитоплазмі клітин в стані спокою.

Ін-1,4,5-Ф3 #: метаболізм

Він починається з реакції фосфорилювання, що каталізується 3-кінази (див. мал.38). В результаті утворюється Ін-1,3,4,5-Ф4, який потім може перетворюватися в Ін-1,3,4-Ф3 під впливом 5-фосфатази або знову дефосфорілірованний до свого попередника. Останню реакцію каталізує 3-фосфомоноестераза інозитол-1,3,4,5-тетракісфосфата

Фосфатаза 5

Карта білка фосфатази 5

Цей фермент вперше був виявлений в мембранах еритроцитів. Згодом було показано, що 5-фосфатаза представлена ​​цілим сімейством мембранозв’язаних і розчинних ізоформ (Shears, 1989; Hansen et al., 1987). Розглянемо властивості однієї з цих ізоформ, розчинній 5-фосфатази з цитозолі тромбоцитів, яка була охарактеризована Конноллі і співавт (Connolly et al., 1985). За даними електрофорезу в додецилсульфату натрію тромбоцитарная форма 5-фосфатази має молекулярну масу 45 кДа.

Цей фермент відщеплює фосфатну групу в положенні 5 у трьох субстратів – Ін-1 ,4.5-Ф3 #, Ін-1 ,3,4,5-Ф4 # і Ін-Ц1 :2,4,5-Ф3 #. Його спорідненість по відношенню інозітолтетракісфосфату (Кm # 1 мкМ) на порядок вище, ніж до Ін-1 ,4,5-Ф3 # (Кm # 10 мкМ), тому при зіставних концентраціях субстратів він гідролізує переважно Ін-1, 3,4, 5-Ф4 #. Для різних форм 5-фосфатази, виділених з інших клітин, також характерно більш високу спорідненість до інозітолтетракісфосфату (Shears, 1989). З іншого боку, максимальна швидкість (Vmax #) гідролізу Ін-1 ,4,5-Ф3 # в 3 рази вище, ніж швидкість гідролізу Ін-1 ,3,4,5-Ф4 #. Розщеплення 5-фосфатазою свого третього субстрату, циклічного ІнФ3 #, йде значно повільніше внаслідок того, що Vmax # цієї реакції на порядок нижче, ніж при гідролізі двох первиз субстратів, а Кm # складає близько 150 мкМ. По всій імовірності, саме завдяки таким кінетичних параметрах 5-фосфатази в стимульованих тромбіном тромбоцитах відбувається істотне накопичення Інц1 :2,4,5-Ф3 # – до однієї третини від Ін-1 ,4,5-Ф3 # (Ishii et al., 1986).

Продукт 5-фосфатазной реакції Ін-1 ,4-Ф2 # розпадається практично повністю по шляху освіти Ін-4-Ф (Inhorm et al., 1987; Morgan et al., 1987; Dillon et al., 1987). Гідроліз Ін-1 ,4-Ф2 # здійснює 1-фосфатаза. Помітне розщеплення Ін-1 ,4-Ф2 # 4-фосфатазою відбувалося тільки в тому випадку, коли його концентрація була дуже висока і становила 10-4 # -10-5 # М (Hughes, Putney, Jr., 1989; Ackermann et al ., 1987).

фосфатаза 1

1-Фосфатаза представлена ​​або однієї, або дуже схожими один на одного ізоформами з молекулярною масою 40-50 кДа. Цей фермент локалізований в цитоплазмі, але невелика частина його може бути сорбувати на мембранах (Shears, 1989). Крім Ін-1 ,4-Ф2 #, 1-фосфатаза гідролізує Ін-1,3,4-Ф3 #, Спорідненість цього ферменту до Ін-1 ,4-Ф2 # і Ін-1,3,4-Ф3 # в різних тканинах, за даними Інхорма і Маджеруса, становить відповідно 4-5 та 5-20 мкМ (Inhorn, Majerus, 1987; Inhorn, Majerus, 1988). Активність 1-фосфатази інгібується міллімолярнимі концентраціями Li по неконкурентних механізму (Shears, 1989).

Фосфатаза інозітолмонофосфатов неспецифічна

Останній продукт у ланцюзі розпаду Ін-1,4,5-Ф3 # до інозитола, інозитол-4-фосфат, гідролізується неспецифічної фосфатазою інозітолмонофосфатов. Цей же фермент розщеплює інші інозітолмонофосфати, що утворюються в ході метаболізму фосфорілірованний похідних інозитол. Фосфатаза інозітолмонофосфатов виділена з мозку в гомогенному вигляді (Gee et al., 1988). Вона представляє із себе димер, утворений двома субодиницями з молекулярною масою 29 кДа. Як і деякі інші фосфатази, що беруть участь в обміні інозітолфосфатов, неспецифічна фосфатаза інгібується іонами Li.

 

Comments are closed.