Люмінесцентна мікроскопія. Електронна мікроскопія. Радіоавтографія.

Люмінесцентна, або флюоресцентна, мікроскопія – метод гістологічного аналізу за допомогою люмінесцентного мікроскопа, в якому використовується явище люмінесценції (свічення) речовин при дії на них короткохвильових променів (ультрафіолетового світла, рентгенівських променів). Деякі біологічні сполуки, присутні в клітинах, характеризуються спонтанної флюоресценцией при попаданні на клітку ультрафіолетових променів. Для виявлення ж більшості інших сполук клітини обробляються спеціальними флюорохромами (флюо-ресцеіном, акридином помаранчевим, коріфосфіном). За допомогою флюорохромами досліджують, наприклад, вміст у клітинах нуклеїнових кислот. При фарбуванні акридином ДНК дає червоно-зелене свічення, а РНК – помаранчеве.

Люмінесцентний мікроскоп широко використовується також для вивчення иммунофлюоресценции. Імунофлюоресценція дозволяє досліджувати в клітці зміст дуже малих кількостей білка. Препарат попередньо обробляють антитілами до досліджуваного білку, міченими флюоресцирующим барвником.

Ультрафіолетова мікроскопія – метод вивчення клітин за допомогою мікроскопів, в яких для освітлення об’єкта використовують ультрафіолетові промені (довжина хвилі яких дорівнює 210-275 нм). Такі мікроскопи мають більшу, ніж звичайні світлові мікроскопи, роздільну здатність. Для спостереження за об’єктом потрібна спеціальна апаратура – електронно-оптичний перетворювач, який охороняє орган зору від дії ультрафіолетових променів.

Електронна мікроскопія. В електронних мікроскопах використовують пучок електронів, довжина електромагнітної хвилі яких у 100 000 разів коротше довжини хвилі видимого світла. Роздільна здатність електронного мікроскопа в сотні і тисячі разів перевищує звичайні оптичні прилади і дорівнює 0,5-1 нм, а сучасні мегавольтних електронні мікроскопи дають збільшення до 1000000 разів. За допомогою електронних мікроскопів отримані численні дані про ультраструктури клітин. Різновидом електронної мікроскопії є скануюча електронна мікроскопія (СЕМ), при якій вивчаються поверхневі структури клітин.
електронна мікроскопія

Цітоспектрофотометрія – метод вивчення хімічного складу клітини, заснований на виборчій поглинання тими чи іншими речовинами променів з певною довжиною хвилі. За інтенсивністю поглинання світла, що залежить від концентрації речовини, проводиться кількісне визначення його змісту в клітині.

Радіоавтографія – важливий інформативний метод, що дозволяє вивчати розподіл в клітинах і тканинах речовин, до складу яких штучно введені радіоактивні ізотопи (3Н, НС, 32Р та ін.) Введений в організм тварини (або в середу культивування клітин) ізотоп включається у відповідні структури (наприклад, мічений тимідину – в ядра клітин, що синтезують ДНК). Метод заснований на здатності включених в клітини ізотопів відновлювати бромисте срібло фотоемульсії, якою покривають зрізи тканини або клітини. Утворені після прояву фотоемульсії зерна срібла (треки) служать свого роду автографами, по локалізації яких судять про включення в клітину застосованих речовин. Застосування мічених тритієм попередників нуклеїнових кислот (тимідину, аденіну, цитидину, урідіна) дозволило з’ясувати багато важливих аспекти синтезу ДНК, РНК і клітинних білків.

Гісто-і іммуноцітохіміческіе методи. В їх основі лежить застосування хімічних реакцій для виявлення розподілу хімічних речовин в структурах клітин, тканин і органів. Сучасні гістохімічні методи дозволяють виявляти амінокислоти, білки, нуклеїнові кислоти, різні види вуглеводів, ліпідів та ін Для виявлення специфічних білків використовують іммуноцітохіміческіе реакції. Для цього отримують специфічні сироватки, що містять антитіла (наприклад, проти білка мікротрубочок – тубуліну). Далі хімічним шляхом з’єднують ці антитіла з флюорохромом (або іншим маркером). Якщо мічені антитіла нанести на гістологічний зріз, вони вступають у з’єднання з відповідними білками клітини і виникає специфічне світіння, видиме в люмінесцентному мікроскопі. Сучасні іммуноцітохіміческіе методи, крім флюорохромами, використовують інші найрізноманітніші специфічні маркери, що дозволяють якісно і кількісно оцінювати вміст у клітині досліджуваних сполук. Модифікацією розглянутого методу є введення мічених антитіл в цитоплазму живих клітин за допомогою мікроманіпуляторів.

Метод культури клітин, тканин полягає у вирощуванні клітин і тканин поза організмом у штучних поживних середовищах (в умовах in vitro). Для отримання ізольованих клітин виробляють попередню обробку матеріалу ферментами трипсином або колагеназою. Метод дозволяє вивчати реакції клітин на різноманітні впливи, механізми регуляції проліферації, диференціювання і загибелі. Особливо важливе значення даний метод має для ембріологічних і цитофізіологічна досліджень, а також для трансплантації ембріональних клітин при лікуванні вроджених і набутих дефектів обміну речовин.

Мікроскопічна хірургія клітини – сукупність методичних прийомів, здійснюваних за допомогою спеціального приладу – мікроманіпулятора. Цей прилад дозволяє проводити різного роду найтонші операції на клітці (введення речовин, видалення або пересадка структурних компонентів клітини, нанесення уколів, розрізів і пр.) і знайшов широке застосування в ембріології.

Цейтрафферная, або уповільнена, мікрокіно-або відеозйомка – вивчення живих клітин. Такий спосіб дозволяє простежити за повільно протікають змінами клітин.

Метод фракціонування (диференціального центрифугування) клітин. Його суть полягає в отриманні з клітин ізольованих структурних компонентів. Заснований на різних швидкостях осадження цих компонентів при обертанні гомогенатов клітин в ультрацентрифуг. Даний метод зіграв і грає дуже важливу роль у вивченні хімічного складу і функціональних властивостей субклітинних елементів – перш за все, органел.

Конфокальна мікроскопія – сучасний метод, що використовує як освітлювача лазерний промінь, який послідовно сканує всю товщину препарату. Інформація про щільність об’єкта по кожній лінії сканування передається в комп’ютер, де спеціальна програма здійснює тривимірну реконструкцію досліджуваного об’єкта.

Слід зазначити, що тут наведено лише самі основні, необхідні для гістологічного освіти лікарів усіх профілів методи гістологічного аналізу. Існують багато десятків інших методів, за якими можна ознайомитися в спеціальній гістологічної і цитологічної літературі.

Comments are closed.