Кальцій: методи вимірювання в цитоплазмі.

Концентрація вільного кальцію (Ca2 +) у цитоплазмі складає в стані спокою 0,1 мкМ і підвищується до 10мкм. Вільний цитоплазматичний кальцій складає малу частку від усього внутрішньоклітинного кальцію. Вперше вимірювання концентрації цитоплазматичного кальцію в живих клітинах вдалося провести в 1967 р. Це було зроблено за допомогою ін’єкції білка акворіна випромінюючого в присутності кальцію видиме світло (470нм). Аналогічним властивістю володіє білок обелін з гідри [Campbell, 1974]. Методи вимірювання кальцію за допомогою цих білків дуже чутливі, головна трудність пов’язана з введенням білків в клітини. Детально методику використання акворіна див. в огляді [Cobbold, Rink, 1987]. У 70-ті роки була розроблена методика вимірювання кальцію за допомогою селективних мікроелектродів [Simon ea, 1978] і адсорбційних металлохромних зондів арсеназо III і антіпірілазо III [Scarpa ea, 1978]. Всі ці методи не знайшли широкого застосування і до початку 80-х років рівень цитоплазматичного кальцію був виміряний для дуже небагатьох типів клітин. Якісний стрибок у вивченні регуляції Кальцева обміну стався в 1981 році, коли був синтезований флоуресцентний зонд квін-2 і запропоновано новий спосіб перенесення його в клітини [Tsien, 1981]. Основою для створення Квін-2 і синтезованих пізніше кальцієвих зондів другого (фуро-2 і індо-1) і третього покоління (флуо-3, рід-2 та ін) послужив кальцієвий хелатор БАФТА [Tsien, 1980] рис.7. За параметрами зв’язування кальцію БАФТА перевершує ЕГТА, у нього на порядок більша селективність для кальцію по відношенню до магнію, більш високі швидкості зв’язування і дисоціації, відсутній вплив протонів на зв’язуванні при pH вище 7,0 [Cobbold, Rink, 1987].

Всі ці зонди мають великий негативний заряд і нездатні проходити через плазматичну мембрану. Транспортування в клітку кальцієвих зондів здійснюється після нейтралізації негативних зарядів карбоксилом приєднанням ацетооксіметільних груп (рис.8 Транспорт в клітку кальцієвих зондів). У цитоплазмі клітин ефірні зв’язки розриваються і вивільняється вільна кислота, здатна зв’язувати кальцій. Завдяки цьому відбувається концентрація зонда в цитоплазмі (в клітинній суспензії 10-20 мкМ, в цитоплазмі 0,5 – 1 мМ). Детально про флоуресцентних зондах для вимірювання концентрації кальцію в цитоплазмі див у книзі [Авдонін, Ткачук, 1994].

Comments are closed.