Гіпотеза про спряженні мт-креатинкінази і ТАН: аналіз.

Проаналізуємо вагомість наведених вище аргументів на користь існування структурно-функціонального спряження між мт-КК і ТАН. Недоліком кінетичних доказів є те, що результати сильно залежать від умов експерименту і, як правило, не дозволяють однозначно трактувати отримані дані. Так, Альтшульд і Браєрлі [Altshuld, ea 1977, Altshuld, ea 1980], а також Боррібек [Borrebaek, ea 1980, Borrebaek, ea 1985] показали, що зниження швидкості синтезу КФ у присутності олігоміціна, яке спостерігали Сакс і співавт. [Saks, ea 1975, Saks. ea 1976], пов’язане з підвищенням концентрації ADP в середовищі інкубації. Додавання в середу великого надлишку піруваткінази в присутності фосфоенолпірувата усувало інгібуючий ефект олігоміціна [Altshuld, ea 1977, Altshuld, ea 1980, Borrebaek, ea 1980, Borrebaek, ea 1985]. Екстраполяція до невизначеної концентрації піруваткінази дає швидкість синтезу КФ, що перевищує швидкість, визначену для фосфорилюється мітохондрій [Altshuld, ea 1980]. Липська та співавт., Які застосували рН-метричну реєстрацію початкової швидкості синтезу КФ мітохондріями у присутності олігоміціна, також знайшли, що вона перевищує швидкість синтезу КФ під час окисного фосфорилювання [Lipskaya. ea 1995]. У дослідах на трансгенних мишах, позбавлених ММ-КК, методом [31P] ЯMP було показано, що потік через мт-КК набагато перевищує максимальну швидкість дихання мітохондрій [Nicolay, ea 1998]. Зниження КmMgATP під час окисного фосфорилювання може мати самі різні причини. Наприклад, воно може бути частково обумовлено тим, що під час окисного фосфорилювання частина мт-КК сходить з мембран в межмембранное простір і / або частина октамер диссоциирует до димерів, так як ці переходи також супроводжуються подібними змінами кінетичних параметрів ферменту [Lipskaya, ea 1982, Lipskaya. ea 1989]. Зменшення під час окисного фосфорилювання величини негативного заряду на поверхні внутрішньої мембрани мітохондрій також може внести свій внесок у зниження Кm для негативно зарядженого MgATP [Wojtczak, ea 1979].

КС1 не є специфічним агентом для солюбілізації мт-КК. Багато речовин можуть солюбілізіровать фермент [Липська ea 1980, Wenger, ea 1985, Brooks, ea 1987, Van_Dorsten, ea 1998], причому ефект залежить не від хімічної природи речовин, а від іонної сили їх розчинів [Липська ea 1980, Wenger, ea 1985 , Brooks, ea 1987]. Якщо у присутності КСl функціональне сполучення мт-КК і ТАН зникає, то це ставить під сумнів можливість існування такого сполучення in vivo, в умовах фізіологічної іонної сили. На жаль, вибір КС1 в якості солюбілізірующего агента не був вдалим, так як Сl-служить конкурентним інгібітором для MgATP як цитоплазматичної [Nichei, ea 1961], так і мт-КК [Hall, ea 1979], тому збільшення KmMgATP присутності КС1 [Kuznetsov , ea 1989] могло бути пов’язано і з інгібуючим дією С1-.

Більш пряму відповідь на питання про існування структурно-функціонального спряження між мт-КК і ТАН може бути отриманий при вивченні ступеня компартментаііі АТР в області активного центру мт-КК під час окисного фосфорилювання з використанням радіоізотопного методу [Erickson-Viitanen, ea 1982, Lipskaya. ea 1995, Altshuld, ea 1977, Липська ea 1980]. У цих дослідах мітохондрії інкубували короткий час в середовищі, що забезпечує протікання окислювального фосфорилювання і креатин-кіназного реакції, у присутності немічених АТР і міченого Рi. В ході окисного фосфорилювання утворювався мічений АТР. Шляхом порівняння ступеня включення мітки в зовнішній розчин АТР і у знову синтезований КФ можна було оцінити прямий внесок утвореного під час окисного фосфорилювання АТР в синтез КФ, тобто оцінити ступінь компартментаціі АТР в області активного центру мт-КК [Erickson-Viitanen, ea 1982]. Слід було очікувати, що якщо обмін АН між активними центрами мт-КК і ТАН пов’язаний з їх прямою передачею в межах комплексу мт-КК-ТАН, то ступінь компартментаціі АТР в активному центрі мт-КК не повинна залежати від концентрації зовнішнього розчину АТР і повинна бути дорівнює 100% або принаймні вона повинна зростати зі збільшенням швидкості окисного фосфорилювання, яке відбувається, наприклад, при збільшенні концентрації АТР у середовищі інкубації з Кр. Тим часом ізотопні досліди групи Бессмана [Erickson-Viitanen, ea 1982] показали, що ступінь компартментаціі знижується із збільшенням концентрації АТР і що максимальний ступінь компартментаціі (при екстраполяції концентрації АТР до нуля) дорівнює лише 50% (рис. 3). Аналогічні результати були отримані при вивченні залежності ступеня компартментаціі ADP в активному центрі мт-КК від концентрації ADP [Barbour, ea 1984]. Ці дані вказують на відсутність прямої передачі АН в області активних центрів двох білків і можуть бути пояснені наявністю дифузійних обмежень в їх оточенні, які проявляють себе тим більше, чим нижче концентрації АТР і ADP, що і призводить до збільшення ступеня компартментаціі АН в активному центрі мт -КК при зниженні концентрації АН в середовищі. Руйнування зовнішньої мембрани мітохондрій дігітоніном усувало компартментацію, що спостерігалася при низьких концентраціях АТР [Erickson-Viitanen, ea 1982]. Так як ці досліди проводилися в середовищі з низькою іонною силою і протягом дуже коротких проміжків часу (5-10 с), то усунення компартментаціі не можна було пояснити солюбілізації мт-КК з мембран мітохондрій або дисоціацією октамер на димери. Був зроблений висновок, що прямий обмін АН між мт-КК і ТАН відсутня, а компартментація обумовлена ​​існуванням бар’єру проникності для АН у вигляді зовнішньої мембрани мітохондрій [Erickson-Viitanen, ea 1982]. Інші ізотопні досліди [Lipskaya. ea 1995, Altshuld, ea 1977, Липська ea 1980] також свідчать про відсутність компартмента АН, обмеженого комплексом мт-КК-ТАН. У дослідах Геллеріха і співавт. однакові градієнти концентрації ADP між міжмембранну простору і зовнішнім середовищем були досягнуті як при роботі мт-КК, так і мітохондріальної аденілаткінази [Gellerich, ea 1994, Laterveer, ea 1996, Gellerich, ea 1992, Laterveer, ea 1997]. Аденілаткіназа є розчинним білком міжмембранну простору і не пов’язана з мембранами мітохондрій [Brdiczka, ea 1990]. Ці досліди вказують на те, що мт-КК і аденілаткіназа знаходяться в єдиному компартменте, обмеженому мембранами мітохондрій, і що додаткові дифузійні бар’єри між двома ферментами всередині цього компартмента відсутні. Ще одна трудність для прямого обміну нуклеотидами полягає в тому, що субстратами для мт-КК служать магнієві комплекси АН, а для ТАН – вільні нуклеотиди [Vignais. ea 1976]. Описані вище термодинамічні досліди [De_Furia, ea 1980, Saks, ea 1985, Sobol, ea 1994] важко аналізувати, так як в зазначених роботах відсутня інформація про характер зміни в часі концентрації всіх учасників креатінкіназной реакції. У зв’язку з цим в групі автора даної статті були поставлені досліди, в яких були простежені ці зміни (результати готуються до публікації). Умови експериментів були близькі до умов Соболєв та співавт. [Sobol, ea 1994]. Ці досліди показали, що перевищення відношення діючих мас креатінкіназной реакції над Ккаж досягається не за рахунок збільшення концентрації КФ, як припускає гіпотеза про структурно-функціональний сполученні, а за рахунок збільшення концентрації ADP в середовищі в той час, коли концентрація КФ вже перестає збільшуватися. Це збільшення відбувалося в однаковій мірі як у присутності, так і у відсутність Кр і було обумовлено АТРазной активністю мітохондрій, яка збільшувалася із збільшенням часу інкубації. Ряд непрямих даних дозволяє припустити, що в цитованих вище роботах [De_Furia, ea 1980, Saks, ea 1985, Sobol, ea 1994] перевищення відношення діючих мас учасників креатінкіназной реакції над Ккаж могло бути досягнуте також за рахунок АТРазной активності. Так, в обговорюваних роботах були використані мітопласти з явно збільшеною у порівнянні з вихідними мітохондріями АТРазной активністю [Saks, ea 1985], рис. 2 і / або тривалі часи інкубації: 20-60 хв [Sobol, ea 1994] і 120-160 хв [De_Furia, ea 1980]. Відомо, що тривала інкубація мітохондрій, і особливо мітопластов, при підвищених температурах (30-37градусов) призводить до їх набухання і роз’єднання окислення від фосфорилювання, що супроводжується стимуляцією АТРазной активності. Остання реакція є незворотною і призводить до зниження концентрації АТР і до накопичення ADP. Як наслідок, відношення діючих мас учасників креатінкіназной реакції, виміряний в цей період, виявляється вище Ккаж цієї реакції, хоча механізм явища не має нічого спільного з функціональним сполученням мт-КК і ТАН. У контрольних дослідах у зазначених роботах були використані відомі інгібітори окисного фосфорилювання – олігоміцін і карбоксіатрактілозід [Saks, ea 1985, Sobol, ea 1994]. Однак вони ж є інгібіторами мітохондріальної АТРази, тому не дивно, що в їх присутності відношення діючих мас учасників креатінкіназной реакції поверталося до величини Ккаж. Інші з використаних контролів – анаеробіоз [Sobol, ea 1994] і додавання ціаніду [De_Furia, ea 1980] – не тільки пригнічують дихання, але інгібують ATРазу мітохондрій, хоча механізм їх дії непрямої [Ленинджер ea 1966]. Таким чином, аналіз кінетичних і термодинамічних аргументів, що приводяться в доказ справедливості гіпотези Сакса-Джекобуса, показує, що вони не дозволяють однозначно трактувати отримані результати. В той же час найбільш прямі досліди по вивченню ступеня компартментаціі АТР і ADP в активному центрі мт-КК з використанням радіоактивної мітки [Erickson-Viitanen, ea 1982, Altshuld, ea 1977, Липська ea 1980, Barbour, ea 1984, Erickson-Viitanen, ea 1982] та ряд інших даних [Gellerich, ea 1994, Laterveer, ea 1996, Gellerich, ea 1992, Laterveer, ea 1997] свідчать проти структурно-функціонального спряження мт-КК і ТАН. Що стосується структурних даних, покладених в основу гіпотези Валліманна-Брдічкі, то, перш за все, освіта комплексів білків ще не доводить існування прямого перенесення метаболітів і навіть їх компартментацію всередині комплексу. Більш того, взаємодія ферментів у комплексі може індукувати зміни в їх третинної і четвертинної структурою, що може знайти своє відображення в зміні їх кінетичних параметрів і може бути інтерпретоване як прояв прямого обміну субстратами без існування цього явища в дійсності. Спроби зшити постулювати білкові комплекси в момент їх утворення за допомогою різних зшиваючих агентів виявилися безуспішними [Schnyder, ea 1994]. Було показано, що порін і ТАН розподілені по поверхні відповідно зовнішньої і внутрішньої мембран випадковим чином [Brdiczka, ea 1991, Kottke, ea 1991]. За даними гістохімічного та імунологічного методів електронної мікроскопії, мт-КК розташована як у місцях контакту зовнішніх мембран [Schlegel, ea 1988, Biermans, ea 1990], так і на мембранах крист [Schlegel, ea 1988, Baba, ea 1976]. Липська та співавт. шляхом зшивання мт-КК з мембранами мітохондрій за допомогою глутарового альдегіду показали, що в мітохондріях є два типи ділянок локалізації мт-КК, між якими активність ферменту розподілена у відношенні 1: 1 [Lipskava. ea 1989], тому можна думати, що в контактних ділянках присутні не більше 50% молекул мт-КК. На існування двох різних ділянок локалізації мт-КК, що перебувають у співвідношенні 1:1, вказують і ізотопні досліди по визначенню ступеня компартментаціі АТР і ADP в активному центрі мт-КК, де було показано, що максимальна ступінь компартментаціі дорівнює 50% [Erickson-Viitanen , ea 1982, Barbour, ea 1984]. Останні дані свідчать також про те, що в безпосередній близькості від ТАН знаходяться не більше 50% мт-КК. Цілком може бути, що це мт-КК. розташована тільки в контактних ділянках або тільки на мембранах крист. У мітохондріях серця щура зміст октамер мт-КК одно 0,125 нмоль / мг білка [Saks, ea 1994], димарів ТАН – 1,27 нмоль / мг білка [Saks, ea 1994], димарів поріна – 0,35 нмоль / мг білка [ Gellerich, ea 1994].

Таким чином, зміст октамер мт-КК в 10 разів менше, ніж зміст димерів ТАН, і в 3 рази менше, ніж димерів поріна. У той же час один октамер мт-КК кінетично може обслужити 40-50 молекул ТАН [Schlegel, ea 1988]. Якщо припустити, що мт-КК “збирає” АТР від великого числа транслоказ в результаті прямого, хоча б і короткочасного, взаємодії [Schnyder, ea 1988], то для цього необхідна дуже енергійна латеральна дифузія цих молекул і наявність якогось механізму, який би забезпечував правильну орієнтацію молекул під час зіткнення. Тим часом внутрішня мембрана мітохондрій побудована в основному з білків [Sjosirand. ea 1978, Satersdai. ea 1978, Fleischer. ea 1976] і володіє високою в’язкістю, що утрудняє дифузію. Нарешті, було встановлено, що активні центри мт-КК звернені не в порожнину центрального каналу, як передбачалося [Schnyder, ea 1988], а розташовані по периферії молекули [Schnyder. ea 1995]. У зв’язку з усім сказаним представляється, що якщо число молекул ТАН, так само як і число пір в зовнішній мембрані мітохондрій, багато більше числа молекул мт-КК і в той же час число оборотів однієї молекули мт-КК багато більше числа оборотів ТАН, успішне функціонування окремих елементів системи не вимагає такого їх структурної взаємодії. яке б забезпечувало пряму передачу АН між їх активними центрами. Достатнім може виявитися їх розташування в одному компартменте – міжмембранну просторі мітохондрій. У цьому випадку, звичайно. АН повинні переміщатися між активними центрами цих білків шляхом дифузії.

Таким чином, в даний час не відомо жодного факту, який би однозначно свідчив на користь розглянутих гіпотез. У той же час є багато фактів, які їм суперечать. Локалізація мт-КК.в контактних ділянках мембран мітохондрій і здатність октамер взаємодіяти з обома прикордонними мембранами може вказувати на участь октамер у формуванні контактних ділянок і в регуляції проникності зовнішньої мембрани для метаболітів. Було показано, що димер мт-КК набагато слабкіше взаємодіє із зовнішньою мембраною [Rojo, ea 1991, Schlegel. ea 1990], і висловлено припущення, що оборотні взаємні переходи октамер і димеру можуть грати регуляторну роль у формуванні межмембранное контактів [Kottke, ea 1991].

Таким чином, можливо, що крім каталітичної функції мт-КК, поряд з іншими білками, виконує структурну роль в області контактів прикордонних мембран [Fritz-Wolf, ea 1996]. Опосередковано, через участь в утворенні контактів, мт-КК може брати участь у регуляції проникності пір [Brdiczka, ea 1998, Beutner. ea 1998].

Comments are closed.