Аналіз гіпотези про компартменізаціі ATP.

Якщо транспортна функція креатінкіназной системи визначається рівноважним положенням креатінкіназной реакції, то як бути з компартментаціей АТР, яка була показана в багатьох дослідах? Але чи була компартментація АТР дійсно показана в цих дослідах? Щоб пояснити досліди Герко та Шлетте [Gerken, ea 1968] компартментаціей АТР, необхідно припустити, що близько 80% АТР в серці міцно пов’язані і не доступні для обміну і дифузії. Однак такому припущенню суперечить цілий ряд фактів.

1. Досліди Арріо-Дюпона і Де Нея з фракціонування серцевих клітин жаби показали, що 90-92% АТР знаходяться в цитоплазмі, а інша частина – в мітохондріях, незалежно від функціонального стану клітин [Arrio-Dupont, ea 1986]. Ці дані добре узгоджуються з вмістом АТР у мітохондріях серця теплокровних тварин (10-15% від загального вмісту) [La ea 1972, Kauppinen, ea 1980]. У той же час Арріо-Дюпон і співавтор [Arrio-Dupont, ea 1986] знайшли, що в цитоплазмі присутні тільки близько 2,5% ADP, що підтверджує раніше встановлений факт [Veech. ea 1979, Perry, ea 1952, Yagi, ea 1960], що значна частка ADP в скелетних м’язах і серце пов’язана з внутрішньоклітинними структурами.

2. Загальний вміст АТР у поперечно-смугастих м’язах і серце одно 8-10 ммоль / кг сирої ваги [Zeleznikar, ea 1991, Veech, ea 1978], тоді як ADP – порядку 1 ммоль / кг [Zeleznikar, ea 1991, Veech, ea 1978 ].

3. За допомогою [Saks, ea 1996] обміну було показано, що практично весь гамма-фосфат АТР у м’язі діафрагми метаболічно активний незалежно від функціонального стану м’яза [Zeleznikar, ea 1991]; в той же час у спокої м’язи тільки 25% ADP метаболічно активні [ Zeleznikar, ea 1990]. Це означає, що навіть якщо в нативних кардіоміоцитах частина АТР в цитоплазмі і пов’язана з розчинними білками, цей зв’язок не є міцною.

4. Розрахунки показують, що частка АТР цитоплазми, пов’язаного з розчинними білками, не може бути велика. Дійсно, відомо, що в 1 кг м’язів міститься 40-50 г водорозчинних білків [Scopes, ea 1973, Lehninger, ea 1975]. Припустимо, що середня молекулярна маса цих білків дорівнює 50 кДа, тоді їх загальний зміст складе 0,8 – 1,0 ммоль / кг. Якщо навіть припустити, що кожна субодиниця цих білків може зв’язати по одній молекулі АТР, то і в цьому випадку концентрація вільного АТР знизиться всього лише на 10%.

5. У фізіологічних умовах під час циклу скорочення-розслаблення частина АТР може бути пов’язана з міозином. Однак концентрація активних центрів міозину в серці дорівнює 150 мкМ [Barsotti, ea 1988], а в скелетних м’язах – 240 мкМ [Ebashi. ea 1968]. Це додатково може дати таку ж кількість зв’язаного АТР.

6. Визначення відносини коефіцієнтів дифузії АТР і КФ в скелетному м’язі і в водному розчині показало, що ці відносини є рівними і не виявляють жодних аномалій в порівнянні з відносинами, знайденими для ряду інших речовин [Kushmerick, ea 1969, Hubley. ea 1995].

7. Досліди деяких авторів з [31Р] ЯMP вказують на можливість існування в скелетних та серцевих м’язах ЯМР-невидимого, пов’язаного з матриксом мітохондрій пулу АТР [Zahler, ea 1987]. Сузукі і співавт. [Suzuki, ea 1990] знайшли в серці щура пул повільно обмінюваного АТР, який склав близько 30% від загального вмісту АТР. Автори припускають, що цей пул включає АТР мітохондрій і, можливо, АТР, зв’язаний з білками цитозолі [Suzuki, ea 1990]. На думку Вайсмана і Кушмеріка, ЯМР-невидимий пул АТР не може перевищувати 5 – 10% від його загального змісту [Wiesman, ea 1997].

Таким чином, результати, отримані різними авторами і різними методами, свідчать про те, що як мінімум 80-90% АТР цитоплазми знаходяться у вільному стані. Якщо велика частина АТР в м’язових клітинах перебуває у вільному стані, то чи можливо виникнення у метаболічних компартментах близько міофібрил і в міжмембранну просторі мітохондрій локальної концентрації АТР, що істотно відрізняється від його середньої розрахованої концентрації в цитоплазмі? Часткову відповідь на це питання дають досліди, проведені на ізольованих мітохондріях серця. Геллер і співавт. [Gellerich, ea 1994] показали, що під час окисного фосфорилювання в середовищі, що містить фосфоенолпіруват і 300-кратний по відношенню до окислювального фосфорилювання надлишок активності піруваткінази, при роботі мт-КК в міжмембранну просторі виникають локальні концентрації АН, причому максимальна величина градієнта концентрацій між межмембранное простір і середовищем була порядка 13 мкМ [Gellerich, ea 1994]. На таку величину концентрація ADP в міжмембранну просторі була вище, а концентрація АТР-нижче, ніж в середовищі. Концентрація вільного ADP в цитоплазмі м’язових клітин дорівнює приблизно 30 мкМ [Veech. ea 1979], тому збільшення на 13 мкМ являє собою збільшення концентрації ADP більше ніж на 30%: у той же час для АТР цей градієнт мізерно малий [Gellerich, ea 1994]. Дуже близька величина градієнта концентрації ADP між міжмембранну простору і зовнішнім розчином (12-13 мкМ) була знайдена при вивченні аденілаткіназной реакції в мітохондріях печінки та серця [Laterveer, ea 1996, Gellerich, ea 1992]. Досліди з мт-КК були відтворені недавно на скінірованних волокнах серця [Kay, ea 2000]. В лабораторії Бессмана та ін було показано [Lipskaya. T.Yu., Geiger. P.J. 1995], що при концентрації АТР у середовищі близько 500 мкМ. ступінь його компартментаііі в активному центрі мт-КК під час окисного фосфорилювання не перевищує 10-12%. Таким чином, вже при концентрації АТР у середовищі порядку 500 мкМ дифузійні обмеження не можуть привести до скільки-небудь істотної компартментаціі АТР в міжмембранну просторі мітохондрій. На це можна заперечити, що in vivo градієнт концентрації АН між межмембранное простір і цитоплазмою може бути вище, ніж це знайдено в дослідах in vitro. Дійсно, КmADP ​​окисного фосфорилювання в ізольованих мітохондріях серця дорівнює 20-30 мкМ [Gellerich, ea 1998]. В той же час було знайдено, що КmADP ​​окисного фосфорилювання в скінірованних волокнах серця і повільних скелетних м’язів дорівнює 300-400 мкМ [Kuznetsov, ea 1996], і це було пояснено існуванням в цитоплазмі особливого білка, який знижує проникність зовнішньої мембрани мітохондрій для ADP і який втрачається в процесі виділення мітохондрій [Kuznetsov, ea 1996, Волощук ea 1998]. Це явище спостерігалося в скінірованних м’язових волокнах серця різних видів тварин [Ventura-Clapier, ea 1998, Kaasik, ea 1999]. Геллер і співавт. [Gellerich, ea 1998] показали, що при додаванні в середу ннкубаціі мітохондрій серця щура 15% декстрану, що імітує онкотичноготиск цитоплазми, КmADP ​​окисного фосфорилювання збільшується з 16 до 50 мкМ. Автори вважають, що КmADP ​​для окисного фосфорилювання в інтактних серцевих клітинах повинна бути порядку 50 мкМ і що величини, знайдені в скінірованних м’язових волокнах, можуть бути завищені у зв’язку зі складною структурою цієї моделі [Gellerich, ea 1998]. У той же час Фром і співавт. [From, ea 1990] показали на перфузованої серце щура, що КmADP ​​для окисного фосфорилювання дорівнює 25 мкМ в умовах, коли швидкість продукції NADH не є фактором, що лімітує дихання. На скінірованних волокнах швидких скелетних м’язів величина КmADP ​​окисного фосфорилювання також не відрізнялася від такої для ізольованих мітохондрій [Ventura-Clapier, ea 1998, Kuznetsov, ea 1996].

Як би там не було, знайдені відмінності [Ventura-Clapier, ea 1998, Gellerich, ea 1998, Kuznetsov, ea 1996, Kaasik, ea 1999] все ще лежать в області мікромолярних концентрацій, тому можна думати, що в фізіологічних умовах градієнт концентрації між межмембранное простір і цитоплазмою може бути суттєвим для ADP, але не для АТР, КФ чи Кр. Компартмент в міжмембранну просторі мітохондрій підтримується не тільки за рахунок існування неперемешіваемих шарів і білок-білкових взаємодій, як це можна очікувати в разі метаболічних компартментов, утворених білками цитоплазми, у тому числі близько міофібрил, але і за рахунок обмеженою проникності зовнішньої мембрани, про що більш докладно буде сказано пізніше. У зв’язку з цим можна припустити, що градієнт концентрації АН, який можуть підтримувати гіпотетичні метаболічні компартменти в цитоплазмі, також буде лежати в області мікромолярних концентрацій. Так, було показано, що в присутності декстрану дифузійний градієнт ADP між компартментом, утвореним пов’язаної із зовнішньою поверхнею зовнішньої мембрани мітохондрій гексокіназою, і зовнішнім середовищем дорівнює ~ 12 мкМ [Laterveer, ea 1997]. Як же, якщо не компартментаціей АТР, можна пояснити досліди, в яких було показано, що при інгібуванні КК або при виснаженні КФ серцевий м’яз перестає скорочуватися, хоча зміст АТР знижується тільки на 10-20% [Gerken, ea 1968, Gudbjarnason, ea 1970 ]?

Однією з найбільш ймовірних причин стомлення в цьому випадку є, по-видимому, збільшення концентрації ADP. Дійсно, якщо стаціонарні концентрації вільних АТР і ADP в кардіоміоцитах рівні відповідно 10 мМ та 30 мкМ, то гідроліз 10% АТР при непрацюючій креатінкі-назна системі повинен призводити до 30-кратного збільшення концентрації ADP, інгібітора міофібріллярного АТРази. Роль MgADP у розвитку діастолічної дисфункції була проаналізцропана в недавній роботі Тіан і співавт. [Tian, ​​ea 1997]. Відомо, що серце більш чутливо до зниження концентрації АТР, ніж скелетні м’язи. Цей факт добре корелює з величинами КmADP ​​у актоміозіна серця і скелетних м’язів: 10 і 170 мкМ відповідно [Ventura-Clapier, ea 1994]. Серед інших чинників можуть мати значення локальне закислення і накопичення Р, [Ventura-Clapier, ea 1994]. Що стосується дослідів, виконаних на ізольованих миофибриллах і на скінірованних м’язових волокнах [Bessman, ea 1980, Savabi, ea 1983, Saks, ea 1984, Veksler, ea 1984, Ventura-Clapier, ea 1985], в яких було показано, що присутність креатінкіназной системи значно покращує всі параметри скорочення, то слід зазначити, що це моделі з великими дифузійними відстанями [Meyer, ea 1984], тому результати цих дослідів можуть оить пояснити не компартментаціей АН, а тим, що в цих дослідах креатінкіназная система прискорювала обмін макроергічних фосфатів по механізмуу описаному Мейером і співавт. [Meyer, ea 1984], причому і одних випадках [Savabi, ea 1983, Veksler, ea 1984, Ventura-Clapier, ea 1985] вирішальне значення мало, по-видимому, зниження стаціонарної концентрації ADP і загальне прискорення транспорту макроергічних фосфатів, а в інших [Bessman, ea 1980] – те, що транспорт макроергічних фосфіду здійснювався головним чином у вигляді молекул КФ. Прихильники ідеї про компартментаціі АТР на підтвердження своєї точки зору часто посилаються па роботи Джонса і співавт. [Aw, ea 1985, Jones, ea 1986]. Тим часом в цих роботах мова йде не про компартментаціі АТР, а про дифузійний градієнті концентрації цієї речовини, що виникає в клітинах печінки після загального зниження концентрації АТР, викликаного спеціальними впливами (гіпоксія та ін) [Aw, ea 1985]. На думку самого Джонса [Jones, ea 1986] в нормальних аеробних умовах градієнти концентрації АТР не можуть бути значними, враховуючи високу внутрішньоклітинну концентрацію цієї речовини. Говорячи про можливі наслідки компартментаціі АТР для метаболізму, ризикнемо провести аналогію між біоенергетикою і макроенергетікой. У біоенергетиці АТР є універсальним джерелом енергії; аналогічну роль в економіці виконує електроенергія. У країнах з розвиненою економікою окремі джерела електроенергії об’єднують в єдину електроенергетичну систему, що забезпечує раціональне використання матеріальних ресурсів та енергії. У біоенергетиці таким принципом організації відповідає уявлення про вільному стані АТР в цитоплазмі і про рівної доступності всього пулу цітоплазменного АТР всім розташованим в цьому компартменте споживаючим АТР системам. Принцип компартментаціі АТР, перенесений на макроенергетіку, можна сформулювати так: “кожен споживач енергії повинен мати свою електростанцію” або він може означати, що споживачі енергії отримують її за принципом конкурсного відбору. Цікаво, що в м’язах видно ознаки існування “єдиної енергетичної системи” у вигляді мітохондріального ретикулума [Bakeeva, ea 1978].

Відомо, що АТРази мають дуже низьку величину КmMgATP в порівнянні з концентрацією АТР в цитоплазмі. З цього факту був зроблений висновок, що висока концентрація АТР взагалі не важлива для функції м’язів [Saks, ea 1994]. Однак, з іншого боку, насичення у фізіологічних умовах активних центрів ферментів АТР може означати, що енергетика нормально функціонуючої м’язової тканини організована таким чином, що джерело енергії – АТР не є лімітуючим фактором.

Comments are closed.